หน้าแรก > คำถาม
คำถาม
PCR กับ rtPCR มีข้อแตกต่างกันอย่าไร
อยากทราบว่าทำไมถึงต้องพัฒนา PCR ให้เป็น rtPCR แทนเพื่ออะไร
ข้อแตกต่างของทั้ง 2 วิธี มีอะไรบ้าง
***** 14/8/51 โพสต์โดย dekjo
คำตอบ
1 จาก 1
เทคนิค Polymerase Chain Reaction (PCR)

   Polymerase Chain Reaction หรือ (PCR) เป็นเทคนิคสำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยอาศัยหลักการ DNA Replication ซึ่งเป็นการสังเคราะห์สายดี เอ็น เอ สายใหม่ จาก ดีเอ็นเอต้นแบบในหลอดทดลองภายในระยะเวลาอันสั้นและได้ดีเอ็นเอสายใหม่เกิดขึ้นเป็นล้านเท่า เทคนิคนี้พัฒนาขึ้นเมื่อปี พ.ศ. 2528 โดย Kary Mullis และคณะแห่งบริษัท Cetus Corporation จุดเด่นของเทคนิค PCR คือ สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ ได้อย่างเฉพาะเจาะจงโดยมีขั้นตอนการทำงานน้อยและใช้เวลาน้อย จนถึงปัจจุบันนี้เทคนิค PCR ได้รับการปรับปรุงและพัฒนาในหลาย ๆ ด้านจนกระทั่งได้รับการยอมรับว่าเป็นเทคโนโลยีที่สำคัญมากต่องานด้านอณูชีวโมเลกุล สามารถนำไปใช้ประโยชน์ได้ทั้งกับงานวิจัยทางชีวโมเลกุลและพันธุวิศวกรรม เช่น การเพิ่มปริมาณยีน (gene cloning) การวิเคราะห์ลำดับเบสของยีน (gene sequencing) การสร้าง ดี เอ็น เอ ติดตาม (DNA probe) และการวิจัยประยุกต์ เช่น การศึกษาการแสดงออกของยีนจาก mRNA การสร้างยีนกลายพันธุ์ (in vitro mutagenesis) การบ่งชี้ตำแหน่งกลายพันธุ์บนยีน (point mutations and deletions) เป็นต้น

   เทคนิค PCR ในการเพิ่มจำนวน DNA


   ภาพที่ 1 องค์ประกอบและโครงสร้างของ DNA การจับคู่กันของเบสคู่สมของสาย DNA สองสายทำให้มีลักษณะเกลียวคู่ กลับทิศทาง
   (ที่มา : Alberts และคณะ, 1983)


   ภาพที่ 2 สาย DNA เกลียวคู่พันกับโปรตีนและหดตัวเป็นสายโครมาตีนจนเห็นเป็นโครโมโซมในระยะเมตาเฟส
   (ที่มา : Freifelder, 1985)

   หลักการของ PCR

   ใช้หลักการพื้นฐานในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ สายใหม่จากสายดีเอ็นเอ ที่เป็นต้นแบบหนึ่งสายด้วยเอนไซม์ DNA poloymerase ซึ่งใช้กันอยู่ทั่วไปในการติดฉลากดีเอ็นเอ และการศึกษาวิเคราะห์ลำดับเบส แต่ PCR สามารถสังเคราะห์ดีเอ็นเอได้คราวละ 2 สายพร้อมกัน โดยใช้ไพรเมอร์ (primer) 1 คู่ ปฏิกิริยา PCR มี 3 ขั้นตอน และหมุนเวียน ต่อเนื่องกันไป ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของแต่ละขั้นตอน

   ขั้นแรก เรียกว่า denaturing เป็นการแยกสายดี เอ็น เอ ที่เป็นต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิสูง 92-95o ซ

   ขั้นที่สองเรียกว่า annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงและจัดให้ไพรเมอร์ ซึ่งเป็นดี เอ็น เอ สายสั้น ๆ (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 14-13 เบส) ที่มีลำดับ เบสเป็นคู่สมกับดี เอ็น เอ ที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน ซึ่งนิยมใช้อุณหภูมิในช่วง 37-60o ซ

   ขั้นที่ 3 เรียกว่า extension เป็นขั้นตอนการสังเคราะห์ดี เอ็น เอ สายใหม่โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลาย 5 ของไพรเมอร์ ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอ ที่เป็นต้นแบบแต่ละสายโดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอ็นไซม์นี้สามารถทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75o ซ เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอเรสที่ใช้ควรจะคง คุณสมบัติอยู่ได้ภายใต้สภาวะของปฏิกิริยา ตลอดทั้งสามขั้นตอน

   ภาพที่ 3 หลักการและขั้นตอนการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ ด้วยเทคนิค PCR
   (ที่มา : PE applied Biosystems)

   จากขั้นตอนที่ 1-3 ซึ่งนับเป็นจำนวน 1 รอบ (one cycle) จะให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า เมื่อจัดให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่จากขั้นที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบจะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ มากมาย ประมาณว่าปฏิกิริยา 20 รอบ สามารถเพิ่มปริมาณสารดีเอ็นเอไม่ได้น้อยกว่า 100,000 เท่า

   สารเคมีที่เกี่ยวข้องในปฏิกิริยา PCR

   เนื่องจากการทำ PCR เป็นการสร้างสายดีเอ็นเอ สายใหม่ในหลอดทดลอง จึงต้องมีการเติมสารเคมีและสารตั้งต้นที่เกี่ยวข้อง เพื่อใช้ในการนำมาสร้างเป็นดีเอ็นเอสายใหม่ สารเคมีที่ต้องใช้ปฏิกิริยา PCR มีดังต่อไปนี้

      1.  Deoxynucleotides (dNTPs) เป็นนิวคลีโอไทด์ ซึ่งเป็นหน่วยย่อยสำหรับนำไปสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่

      2.  DNA polymerase เป็นเอนไซม์สำหรับสังเคราะห์ดีเอ็นเอให้ช่วยเร่งปฏิกิริยาเชื่อมต่อนิวคลีโอไทด์ใหม่เข้ากับไพรเมอร์

      3.  Primer เป็นดีเอ็นเอเริ่มต้นสายสั้น ๆ ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบของการสังเคราะห์ ในการทำ PCR จึงต้องทราบลำดับเบสของดีเอ็นเอที่ต้องการจะเพิ่มจำนวน เพื่อใช้ในการสร้างไพเมอร์จำเพาะ

      4.  PCR buffer เป็นสารละลายที่ควบคุมสภาวะของการทำปฏิกิริยาให้เหมาะสม เช่น pH และเกลือต่าง ๆ ซึ่งจะต้องมีอนุมูลแมกนีเซียม (Mg++) อยู่ด้วย

      5.  Template คือดีเอ็นเอต้นแบบหรือยีนส่วนที่ต้องการเพิ่มปริมาณ หรือเป็นตัวอย่างดีเอ็นเอ ที่ต้องการนำมาตรวจหาดีเอ็นเอจำเพาะ

   สารเคมีที่เป็นส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR จะผสมกันไว้ในหลอดทดลองเล็กปริมาตรสาร 20-100 ไมโครลิตร เมื่อนำหลอดส่วนผสมไปใส่ไว้ในเครื่องควบคุมอุณหภูมิที่เรียกว่า DNA thermal cycler (นิยมเรียกว่าเครื่อง Pcr) ที่ปรับอุณหภูมิได้ตามโปรแกรมที่กำหนด จะเกิดการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ขึ้นในหลอด เมื่อเกิดปฏิกิริยาจนครบรอบและระยเวลาที่กำหนดจะได้ผลผลิตดีเอ็นเอ ขนาดที่ต้องการเป็นจำนวนมาก

   เครื่องเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (PCR machine)

   เครื่อง Thermal cycler หรือ PCR machine เป็นเครื่องที่จำเป็นในการทำ PCR ซึ่งเครื่องนี้มีอยู่หลายแบบและหลายระบบขึ้นกับการออกแบบและการคิดค้นของบริษัท ผู้ผลิต ข้อสำคัญคือต้องสามารถปรับเปลี่ยนอุณหภูมิได้เป็นขั้นตอนตามที่ตั้งไว้และทำงานหมุนเวียนกันหลาย ๆ รอบได้ตั้งโปรแกรมการทำงานได้และการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ ในแต่ละขั้นตอนใช้ระยะเวลาไม่นานนักระยะเวลาที่ใช้แต่ละขั้นคือ denaturing annealing และ extension อยู่ในช่วง 15 วินาที ถึง 10 นาที ดังนั้นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยวิธี PCR 25-40 รอบ จะใช้เวลาประมาณ 1.5-5 ชั่วโมง

   การวิเคราะห์ผลผลิตดีเอ็นเอจากปฏิกิริยา PCR

   ดีเอ็นเอที่เกิดจากปฏิกิริยา PCR ในหลอดทลองจะไม่สามารถมองเห็นด้วยตาเปล่าได้ ดังนั้นเพื่อตรวจหาดีเอ็นเอผลผลิตจะต้องนำตัวอย่างที่ทำ PCR มาแยกหาดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคที่เรียกว่า agarose gel electrophoresis ซึ่งเป็นการแยกดีเอ็นเอด้วยกระแสไฟฟ้าบนแผ่นวุ้น (Agarose gel) โดยระยะทางที่ดีเอ็นเอสามารถเคลื่อนที่ไปได้จะขึ้นอยู่กับขนาดของดีเอ็นเอและกระแสไฟฟ้าที่ใช้ ดีเอ็นเอที่แยกโดยวิธีนี้สามารถมองเห็นได้เมื่อย้อมด้วยสีพิเศษ ซึ่งจะเรืองแสงเมื่อเจอกับแสงอุตร้าไวโอเลต ซึ่งจะเห็นแถบดีเอ็นเอเรืองแสงบนแผ่นวุ้น (ภาพที่ 4)

   ภาพที่ 4 แถบดีเอ็นเอที่แยกบนแผ่นวุ้นโดยวิธี agarose gel electrophoresis
   และย้อมด้วยสี ethidium bromide ถ่ายภาพภายใต้แสง ultraviolet

   ประโยชน์ของ PCR ในการตรวจวินิจฉัยโรค

   ปัจจุบันนี้นับได้ว่า PCR เป็นเทคนิคสำคัญมากในงานอณูชีวโมเลกุล ทั้งที่เป็นงานพื้นฐานในห้องปฏิบัติการไปจนถึงการประยุกต์ใช้ทางการแพทย์และการเกษตรสามารถใช้ในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ศึกษาความผันแปรหรือกลายพันธุ์ของพันธุกรรมหรือยีน ทำแผนที่ยีนและศึกษาลำดับเบสของยีนของสิ่งมีชีวิตได้ทุกชนิด ทั้งนี้เนื่องมาจากเทคนิคนี้สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอที่สนใจศึกษาให้มีปริมาณมากในเวลาอันรวดเร็ว และเป็นเทคนิคที่ทำได้ง่าย

   ประโยชน์ของ PCR ทางด้านการแพทย์ ได้แก่ การตรวจวินิจฉัยโรคโดยการตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของโรค (เช่น โรคเอดส์,วัณโรค,มาเลเรีย) การตรวจหายีนก่อมะเร็ง (เช่น มะเร็งเต้านม,มะเร็งลำไส้ใหญ่) ซึ่งประโยชน์ของ PCR ทางการแพทย์เหล่านี้ทำให้การวินิจฉัยโรคเพื่อป้องกันและรักษาเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น

   ทางด้านการเกษตร PCR มีบทบาทมากในงานด้านการปรับปรุงพันธุ์พืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช การตรวจวินิจฉัยโรคสายพันธุ์พืชต้านทานโรค การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อโรครวมทั้งศึกษายีนกับตัวอื่น ๆ ของพืชและเชื้อโรค และการแสดงออกของยีนเหล่านั้นได้ ซึ่งเทคนิค PCR นี้ช่วยให้เข้าใจถึงพันธุกรรมของเชื้อโรคพืชและ พืชอาศัย ตลอดจนการนำไปใช้ในการป้องกันกำจัดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรคอื่น ๆ

   ขณะนี้เทคนิค PCR ได้ถูกนำมาใช้ในอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงกุ้ง ซึ่งเป็น อุตสาหกรรมส่งออกที่ทำรายได้ให้กับประเทศไทย 4-5 หมื่นล้านบาทต่อปี แต่ในปัจจุบันนี้เกษตรกรเริ่มประสบปัญหาจากโรคระบาดในบ่อเลี้ยงกุ้ง ซึ่งมีผลต่อผลผลิตกุ้งส่งออกทำให้ประเทศไทยสูญเสียรายได้ถึงปีละ 1-2 หมื่นล้านบาท สาเหตุของโรคระบาดในกุ้งที่พบ ส่วนใหญ่เกิดจากเชื้อไวรัสซึ่งต้องใช้เทคนิค PCR ในการตรวจสอบ ทำให้สามารถป้องกันการแพร่ระบาดของโรคได้ทันท่วงที นอกจากนี้การคัดเลือกสายพันธุ์กุ้งที่ดีเพื่อใช้ในการผสมพันธุ์ซึ่งมีความแปรปรวนพันธุกรรม (genetic diversity หรือ Variation) สูงจะไม่สามารถดำเนินไปได้ถ้าไม่ใช้วิธีการคัดเลือกที่มีประสิทธิภาพ และถูกต้องถึงระดับ พันธุกรรม

RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) is a sensitive method for the detection of mRNA expression levels. Traditionally RT-PCR involves two steps: the RT reaction and PCR amplification. RNA is first reverse transcribed into cDNA using a reverse transcriptase as described here, the resulting cDNA is used as templates for subsequent PCR amplification using primers specific for one or more genes. RT-PCR can also be carried out as one-step RT-PCR in which all reaction components are mixed in one tube prior to starting the reactions. Although one-step RT-PCR offers simplicity and convenience and minimizes the possibility for contamination, the resulting cDNA cannot be repeated used as in two step RT-PCR.

สรุปคือ  PCR ใช้ทำกับ DNA  ส่วน RT-PCR ใช้กับ RNA  ขั้นตอนต่างกันนิดหน่อย  ที่ว่า  RT-PCR ต้องใส่ enzyme Reverse transcriptase เพื่อทำให้ RNA ถอดเป็น DNA แล้วเอาไปทำต่อตามขั้นตอนของ PCR
14/8/51 โพสต์โดย Maymaykung
นอกจากนี้คุณอาจสนใจ
.....แตกต่าง....
เรื่องจริง กับ เรื่องแต่ง แตกต่างกันอย่างไร
ถ้ามีคนมาบอกคุณว่า หัดคิดให้เหมือนคนบ้าง คุณจะทำยังไง
การมีหรือไม่มีครอบครัวมันดีแตกต่างกันอย่างไร?
ความคิดแปลกใหม่ ความคิดสร้างสรรค์ แตกต่างกันอย่างไร
เข้าสู่ระบบ
ดู กูรู ใน: โทรศัพท์มือถือ | คลาสสิก
©2014 Google - นโยบายส่วนบุคคล - ผู้ช่วยกูรู